Un kit di assemblaggio del DNA per sbloccare CRISPR

Funzionalità del 30 agosto 2023

Questo articolo è stato rivisto in base al processo editoriale e alle politiche di Science X. Gli editori hanno evidenziato i seguenti attributi garantendo al tempo stesso la credibilità del contenuto:

verificato

pubblicazione sottoposta a revisione paritaria

fonte attendibile

correggere le bozze

di Thamarasee Jeewandara, Phys.org

Le brevi ripetizioni palindrome regolarmente interspaziate (CRISPR) e la proteina 9 associata a Crispr (CRISPR/Cas9) sono ora un metodo rivoluzionario e ben noto per ingegnerizzare le cellule microbiche.

Un vantaggio chiave di CRISPR rimane la progettazione del ceppo per facilitare l'integrazione cromosomica per consentire l'assemblaggio di DNA privo di marcatori. Questi sistemi di editing sono estremamente vantaggiosi; tuttavia, il loro assemblaggio non è del tutto semplice e potrebbe impedirne l'utilizzo e le applicazioni.

In un nuovo rapporto pubblicato su Nature Communications Biology, Tigran V. Yuzbashev e un gruppo di ricerca hanno identificato i limiti degli attuali kit di strumenti Cas9 progettati per rendere le tecniche CRISPR più facili da accedere e implementare. Hanno discusso tre diversi metodi consolidati e li hanno combinati per formare un kit di strumenti completo per un’ingegneria metabolica efficiente utilizzando CRISPR/Cas9.

Un unico kit di strumenti composto da 147 plasmidi per generare e caratterizzare una libreria di 137 promotori per costruire un acido omogentisico in laboratorio.

Il sistema CRISPR/Cas9 può apportare modifiche genomiche rapide, precise e senza cicatrici per fornire un ambito significativo per progettare ceppi microbici per la bioproduzione. L'ingegneria metabolica dei lieviti, ad esempio, costituisce un'area in rapida crescita nella biologia ingegneristica per la produzione sostenuta di prodotti chimici, combustibili, alimenti e prodotti farmaceutici.

I lieviti hanno un potenziale metabolico come le cellule eucariotiche e sono quindi più facili da progettare e coltivare su larga scala. Di conseguenza, i bioingegneri hanno progettato e sviluppato sistemi CRISPR per i lieviti.

Grazie alla sua elevata efficienza, CRISPR consente modifiche genomiche senza marcatori. In questo lavoro, Yuzbashev ha assicurato l'ottimizzazione dei ceppi e facilitato i progetti di ingegneria metabolica identificando tre miglioramenti del sistema CRISPR/Cas9 per l'ingegneria del lievito. I metodi includevano: 1) il facile scambio tra modifiche marcatrici e senza marcatore, 2) il rapido scambio di bracci di omologia per determinare diverse posizioni di integrazione e 3) un metodo semplice per clonare i gRNA.

Per consentire l’integrazione priva di marcatori basata su CRISPR, il team ha scelto una rottura del doppio filamento indotta da Cas9, che doveva essere riparata per realizzare la proliferazione cellulare. Gli scienziati hanno reso ciò possibile utilizzando un modello o donatore, integrato tramite ricombinazione omologa o unione finale non omologa (NHEJ), senza integrazione. Il processo di unione delle estremità non omologhe è osservato nella maggior parte delle specie fungine, compreso il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae.

Nelle specie con un meccanismo NHEJ predominante, il team ha migliorato la ricombinazione omologa eliminando i geni NHEJ. Se un metodo privo di marcatori non ha avuto successo, gli scienziati mirano successivamente a migliorare l’integrazione assistita da CRISPR-Cas9 per tornare facilmente all’integrazione basata sui marcatori.

L'integrazione assistita da Cas9 richiede in genere un modello donatore costituito da una cassetta integrata affiancata da due bracci di omologia. Il team ha teorizzato che l’integrazione ideale di CRISPR/Cas9 dovrebbe scambiare bracci di omologia su costrutti donatori Cas9 pre-valutati tramite una reazione di assemblaggio Golden Gate semplificata.

Inoltre, i promotori sono un elemento chiave per qualsiasi progetto di ingegneria metabolica per reindirizzare il flusso verso i prodotti di interesse. Yuzbashev et al. hanno utilizzato il lievito industriale Yarrowia lipolytica per sviluppare un kit di strumenti di ingegneria metabolica che combinava l’editing genetico e le strategie di assemblaggio del DNA per un’elevata efficienza e versatilità.